Vraag:
Hoe verbreek je celklonten tijdens het passeren?
Rob O'Callahan
2011-12-22 07:55:37 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ik werk met HepG2-cellen en ze houden er echt van om klontjes te vormen. Op en neer pipetteren in TrypLE lijkt niet erg effectief om ze op te splitsen.

Rob: kan deze vraag worden beantwoord door Google? Als het kan, kom dan terug en plaats een antwoord op uw vraag. Hier is een hint: http://hepg2.com/index.html
Drie antwoorden:
#1
+5
Jeremy
2012-01-17 09:40:10 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ik merk dat ik alleen klonters krijg (met HeLa en vergelijkbare celtypen) als ik ze te lang in Tryple laat staan. Over het algemeen laat ik ze ~ 8 minuten op kamertemperatuur (niet heet) Tryple, daarna kantel ik de schaal met het deksel eraf, zodat ik de "glans" van de cellen op de schaal kan zien (dit gebeurt natuurlijk in de afzuigkap) ). Vervolgens blaas ik de glans op met Tryple met een pipet van 1000 ul, die de cellen losmaakt. Deze zijn over het algemeen veel minder samengeklonterd dan wanneer ik de Tryple de cellen laat losmaken.

#2
+3
kasia
2012-01-15 19:52:12 UTC
view on stackexchange narkive permalink

In sommige protocollen voor het opzetten van primaire culturen (bijvoorbeeld van beenmerg van muizen of endometrium van ratten), is er een stap waarbij celsuspensie door een grote naald moet worden geduwd om klonters te verwijderen. Dit brengt natuurlijk een hoog risico met zich mee om de cellen te beschadigen, dus soms wordt in plaats daarvan collagenase gebruikt.

Het kan ook nuttig zijn om je cellen te wassen met PBS zonder ionen voordat ze passeren en tripsin met EDTA te gebruiken. Dat zou in ieder geval wat calcium van de plaat moeten verwijderen, zodat de werking van adhesie-eiwitten zou worden geremd.

#3
+3
Valentinos
2012-02-17 21:28:23 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Celklonters die niet dissociëren met rigoureus pipetteren, kunnen heel goed worden veroorzaakt door vrij DNA in uw celsuspensie (d.w.z. als u te lang getrypsiniseerd bent). Vrij DNA trekt cellen aan die zich volledig binden en klonten vormen.

Twee mogelijke manieren om van deze klonten af ​​te komen:

  1. Centrifugeer uw celsuspensie gedurende 2 minuten bij 5000 tpm met versnelling aan (bij 4) en rem (bij 3) waardoor zwaardere moleculen kunnen neerslaan. Zuig vervolgens ~ 0,5 ml van de bovenkant van de suspensie op en breng over naar een nieuwe kolf. Herhaal indien nodig.
  2. Gebruik DNAse in concentraties van 20-100 µg / ml (concentratie als resultaat van persoonlijk gebruik), zolang je niet van plan bent DNA-gerelateerde experimenten uit te voeren.

U kunt altijd teruggaan en een nieuwe ampul kopen van de cellijn waarvan u geen klontjes wilt hebben :)



Deze Q&A is automatisch vertaald vanuit de Engelse taal.De originele inhoud is beschikbaar op stackexchange, waarvoor we bedanken voor de cc by-sa 3.0-licentie waaronder het wordt gedistribueerd.
Loading...