Vraag:
Wat bepaalt een succesvolle eiwitexpressie in E. coli?
Gergana Vandova
2011-12-17 01:54:43 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Sommige eiwitten komen goed tot expressie in een heterologe gastheer; anderen - niet doen. Er zijn een paar vereisten bekend om de eiwitexpressie te bepalen, zoals een sterke promotor (zoals T7) voor transcriptie en een sterke ribosoombindingsplaats voor translatie. Ik werk met een eiwit dat uit 2 subeenheden bestaat - alfa en bèta. Beiden bevinden zich op een plasmide met T7-promotor vóór de bèta-subeenheid (d.w.z. het construct is de T7-promotor, CDS voor bèta-subeenheid, CDS voor de alfa-subeenheid). De bèta-subeenheid drukt goed uit, maar de alfa niet. Denk je dat dit iets te maken heeft met de lokale omgeving (promotors, RBS'en, enz.) En hoeveel hangt het daarvan af? Hoe kan ik de eiwitexpressie verhogen?

Sommige aspecten zijn mij niet helemaal duidelijk. De twee subeenheden worden uitgedrukt op afzonderlijke plasmiden, of? En alles in de plasmiden is hetzelfde, behalve de feitelijke eiwitsequentie?
De twee subeenheden bevinden zich op hetzelfde plasmide. De plasmidesequentie begint met T7-promotor, RBS1, subeenheid bèta, RBS2, subeenheid alfa. De RBS-sequenties zijn een beetje anders, dus ik dacht erover om ze hetzelfde te maken, maar dit zou geen groot effect moeten hebben op de eiwitexpressie. (ze liggen heel dicht bij de consensussequentie).
Vier antwoorden:
#1
+9
Mad Scientist
2011-12-17 02:31:16 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Een belangrijk aspect bij het tot expressie brengen van een eiwit van een ander organisme in E. coli is dat het codongebruik van het oorspronkelijke organisme waarschijnlijk verschilt van het codongebruik van de E. coli die voor expressie wordt gebruikt ( Codongebruiksbias).

Hoewel de genetische code gedegenereerd is, zijn niet alle codons gelijk. Ze kunnen voor hetzelfde aminozuur coderen, maar organismen hebben de neiging om specifieke codons te prefereren boven andere en de tRNA's voor die codons zijn meestal in verschillende concentraties aanwezig. Als je nu veel codons in je sequentie hebt die zeer zeldzaam zijn in E. coli, zal de expressie eronder lijden omdat het tRNA voor die codons niet in voldoende hoge concentraties aanwezig is om de translatie te ondersteunen.

Daar zijn twee manieren om dat te compenseren, ofwel je zorgt ervoor dat je E. coli meer van de zeldzame tRNA's produceert, of je optimaliseert je sequentie om verschillende codons te gebruiken. Voor de eerste oplossing kun je bepaalde E. coli-stammen kopen die plasmiden bevatten die coderen voor de tRNA's die zeldzaam zijn in E. coli, een van die stammen is bijv. de Rosetta BL21-stam.

Voor het optimaliseren van het codongebruik zijn er verschillende bedrijven die aanbieden om geoptimaliseerde sequenties te synthetiseren. Er zijn ook tools online beschikbaar, maar daar heb ik geen directe ervaring mee.

De optimalisatie is ook niet zo eenvoudig als elke keer het meest voorkomende codon gebruiken, het is aangetoond dat het optimaliseren van de codons om overeen te komen de translatiesnelheid in het oorspronkelijke organisme kan de expressieopbrengsten verhogen. Voor sommige eiwitten kunnen pauzeplaatsen tijdens de vertaling nodig zijn om een ​​goede vouwing te garanderen. Als het eiwit niet correct vouwt, wordt het snel afgebroken en zal je opbrengst eronder lijden. Dit wordt beschreven in het artikel "Heterologe proteïne-expressie wordt verbeterd door de codongebruiksfrequenties van het doelgen te harmoniseren met die van de expressiegastheer" van Angov et al.

Een mooi overzicht over het hele onderwerp vind je in het artikel "You're one in a googol: optimizing genes for protein expression" van Welsh et al.

Bedankt, gekke wetenschapper! Ja, ik heb nagedacht over codonoptimalisatie en dit staat zeker op mijn takenlijst. Sorry dat ik het vergat te vermelden. DNA 2.0 heeft software die uw sequentie omzet in een geoptimaliseerde sequentie. Ik heb ook gehoord over Rosetta BL21, maar ik heb hem nooit gebruikt. We willen misschien ook vasthouden aan onze eigen soort, omdat het de heterologe producent is van of het geneesmiddel van interesse. Ik maak me een beetje zorgen over codonoptimalisatie, juist vanwege het verkeerd vouwen, maar ik denk dat we het moeten doen.
Maar dit verklaart nog steeds niet waarom de andere subeenheid beter tot expressie komt, evenals andere eiwitten van hetzelfde natuurlijke organisme goed tot expressie komen in E. coli. Daarom denk ik dat het meer een vraag is over de controle-elementen van transcriptie en vertaling, dan over het zeldzame codongebruik.
@GerganaVandova Je zou het codongebruik van je twee subeenheden moeten vergelijken, het kan toevallig zijn dat de ene meer zeldzame codons gebruikt dan de andere.
Ik woon een lezing bij van Claes Gustafsson van DNA2.0 - en ik denk dat we dit al wisten - dat codongebruik nuttig is, maar niet altijd werkt. ze hebben een gepatenteerde methode die betrouwbaarder is ...
#2
+6
Amy
2011-12-22 05:41:32 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Heb je geprobeerd je twee genen op twee afzonderlijke plasmiden te plaatsen (met natuurlijk een verschillende oorsprong van replicatie en antibiotica-selectie) en op die manier gezamenlijk tot expressie te brengen? Als de eerste van de twee subeenheden goed tot expressie komt en de tweede niet, is dat waarschijnlijk omdat de ribosomen van het mRNA vallen voordat ze het tweede gen volledig hebben getranscribeerd. Zijn de genen van eukaryote oorsprong? Ik denk dat het moeilijk is om E. coli-ribosomen te 'misleiden' om heterologe sequenties als een operon te behandelen, maar misschien zou iemand met meer kennis van prokaryote vertaling kunnen helpen.

Eigenlijk zou je gewoon een tweede T7-promotor vooraan toevoegen. van gen 2 zou waarschijnlijk heel wat helpen:

Genen worden ofwel van individuele promoters ofwel van een enkele promoter getranscribeerd, wat leidt tot een lang polycistronisch mRNA. Er is gerapporteerd dat polycistronische expressie leidt tot een lagere expressie van het meer stroomafwaarts gecodeerde eiwit, dat kan worden benut om de stoichiometrie van een eiwitcomplex te beïnvloeden (9). Een veelvoudig hogere expressie met individuele promoters in vergelijking met polycistronische transcriptie is gerapporteerd (10). ( Bron)

Ik weet uit persoonlijke ervaring dat co-expressie met behulp van twee plasmiden heel goed kan werken met de juiste genen!

Bedankt voor je antwoord. Ik hou van het idee om een ​​extra T7-promotor toe te voegen, hoewel het hebben van repetitieve reeksen tot andere toekomstige problemen kan leiden (ik wil niet in details treden). Maar ik werk met genen die 3 keer zo groot zijn en één promotor voor de 2 subeenheden werkt goed. Misschien is het erg sequentiespecifiek.
#3
+2
Nick T
2011-12-17 11:19:41 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Mad Scientist behandelde mogelijke codon-bias-problemen (die kunnen worden verbeterd met Rosettas), maar meer in het algemeen heb ik een enorme variabiliteit gezien in expressiesnelheden tussen verschillende vectoren (pET-28 versus pET-24) zonder enige duidelijke reden. Ons laboratorium heeft enorm veel succes gehad met IPTG-induceerbare vectoren (gaande van pBC-SK tot pET-24 verhoogde expressie 50-voudig).

Naast expressie kan het eiwit verloren gaan bij het bereiden van het celvrije extract. Het kan zijn dat het niet in de celpellet zit als het wordt geëxporteerd met dank aan een signaalpeptide, of het kan worden weggegooid in de "puin" -pellet wanneer gelyseerde cellen worden rondgedraaid als het slecht oplosbaar is. Ik heb een theorie gehoord dat oplosbaarheidsproblemen kunnen worden overdreven door vectoren die de exportmachines verzadigen, die zowel de synthese kunnen belemmeren als / of zo effectief zijn dat ze alleen maar neerslag veroorzaken. De pET System Manual suggereert dat langere ('s nachts) afkolftijden bij lagere (15-20 ° C) oplosbaarheidsproblemen kunnen helpen. Wat de reden ook is, het wegwerken van het signaalpeptide verhoogde de expressie van veel van onze eiwitten drastisch.

#4
+2
Gergana Vandova
2012-01-07 01:15:01 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ik vond een heel mooi artikel: Designing Genes for Successful Protein Expression, dat de meeste factoren behandelt die eiwitexpressie bepalen. Ik post er delen van, omdat ik zeker weet dat het voor sommigen van jullie nuttig zal zijn.

De vertaling kan worden gecontroleerd op het niveau van initiatie en verlenging. Het begin van de translatie is voornamelijk afhankelijk van de sequentie van de ribosoombindingsplaats (RBS) en de vroege secundaire structuur van mRNA. Andere determinanten van eiwitexpressie zijn minder goed begrepen, maar even krachtig.

1. Initiatie van vertaling

Een sleutelcomponent die de initiatie van vertaling in prokaryoten beïnvloedt, is de RBS die optreedt tussen 5 en 15 basen stroomopwaarts van het open leesframe (ORF) AUG start codon. Binding van het ribosoom aan de Shine-Dalgarno (SD) -sequentie binnen de RBS lokaliseert het ribosoom aan het initiatiecodon ... Affiniteit van de RBS voor het ribosoom is een kritische factor die de efficiëntie bepaalt waarmee nieuwe polypeptideketens worden geïnitieerd. Deze interactie concurreert met mogelijke basenpaarinteracties waarbij het RBS-gebied betrokken is en die zich binnen het mRNA zelf kunnen vormen. Aldus zijn SD-sequenties met zwakkere basenparing aan het ribosoom gevoeliger voor interferentie door mRNA-structuur. Sommige experimenten suggereren echter dat SD-sequenties met een te sterke affiniteit schadelijk kunnen zijn, vooral bij lagere temperaturen, door de initiële verlenging te vertragen. Ook cruciaal is dat de afstand tussen het RBS en het startcodon, waarbij 5-7 basen van de consensus SD AGGAGG optimaal zijn.

Talrijke bewijzen suggereren dat de initiële 15-25 codons van het ORF speciale aandacht verdienen bij genoptimalisatie. Studies hebben aangetoond dat de impact van zeldzame codons op de translatiesnelheid bijzonder sterk is in deze eerste codons, voor expressie in zowel Escherichia coli als Saccharomyces cerevisiae. In E. coli lijkt het wegvallen van peptidyl-tRNA tijdens translatie van de initiële codons te worden geaccentueerd door de aanwezigheid van zeldzame NGG-codons. Deze effecten lijken onafhankelijk te zijn van de lokale secundaire structuur van mRNA. Het is ook waar dat expressie kan worden teruggewonnen door 5'-sequentievervanging, zelfs voor sequenties die geen bijzonder sterke mRNA-structuur vertonen of zeldzame codons of andere duidelijk schadelijke elementen in dit gebied bevatten.

2. Codonbias

De tweede manier waarop gastheercodonfrequenties kunnen worden gebruikt, is door de gastheercodonfrequenties in het ontworpen gen te matchen. Dit kan eenvoudig worden gedaan door elk codon te kiezen met een waarschijnlijkheid die overeenkomt met de frequentie van het gastheercodon ... Door sets van genen te gebruiken die breed in genontwerpkenmerken variëren, stellen Welch et al. ontdekte dat variatie in de gebruiksfrequenties van synonieme codons een diepgaand effect had op de hoeveelheid eiwit die in E. coli wordt geproduceerd, onafhankelijk van lokale 5 'sequentie-effecten. Variatie van ten minste twee orden van grootte in expressie werd gezien als gevolg van substitutie voorbij de initiële 15 codons van het ORF. Deze variatie was sterk gecorreleerd met de globale codongebruiksfrequenties van de genen, hoewel de codonfrequenties gevonden in de hoogst tot expressie gebrachte varianten niet overeenkwamen met die gevonden in het genoom of in sterk tot expressie gebrachte endogene genen van E. coli. Multivariate analyse toonde aan dat de frequenties van specifieke codons voor ongeveer zes aminozuren de waargenomen verschillen in expressie konden voorspellen. Het is niet duidelijk wat de biochemische basis is voor deze correlatie.

3. mRNA-structuur en translationele verlenging

Hoewel er veel bewijs suggereert dat de mRNA-structuur de translationele initiatie in zowel prokaryoten als eukaryoten kan verstoren, zijn de effecten van structuur op verlenging minder goed begrepen. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan de intrinsieke helicase-activiteit van ribosomen, die translatie door zelfs zeer sterke haarspeldbochten mogelijk maakt en kan voorkomen dat veel structuren de translatiesnelheid in prokaryoten of eukaryoten beperken. Misschien nog belangrijker is dat de mRNA-structuur moeilijk te voorspellen is, vooral voor actief vertaalde berichten die continu in beweging zijn tussen verschillende gevouwen en ongevouwen toestanden.

4. Eiwitspecifieke factoren die voor extra complexiteit zorgen

Het eiwit kan bijzonder onstabiel zijn in de gastheer, vooral als het slecht gevouwen is vanwege inherente instabiliteit, gebrek aan voldoende prothetische factoren of onjuiste posttranslationele factoren modificatie ... Expressie van uitgescheiden eiwitten en membraaneiwitten kan worden beperkt door mechanismen om deze eiwitten naar het membraan te sturen. Het is zelfs mogelijk dat de aminozuursequentie van het eiwit de translatie-efficiëntie beperkt. Er wordt bijvoorbeeld gedacht dat proline langzaam wordt vertaald in E. coli, ongeacht welk codon wordt gebruikt.

Expressie van het eiwit kan toxisch zijn voor de cel, wat leidt tot instabiliteit van de expressievector of gastheeronderdrukking van eiwitsynthese ... Een gebruikelijke strategie om toxiciteit te verminderen is om expressie te verlagen tot aanvaardbare niveaus. Promotors met verschillende sterkte kunnen waardevolle hulpmiddelen zijn voor het vinden van een optimale expressiesnelheid voor maximale opbrengst ... Een mogelijke manier om toxiciteit van sommige eiwitten te vermijden, is door expressie naar het periplasma of de media te sturen. Dit kan worden bereikt door N-terminale fusie van een secretiesignaalsequentie.

Lees voor meer informatie het hele artikel. Ik raad ook aan om ontwerpparameters te lezen om de synthetische genexpressie in Escherichia coli te controleren.

Bedankt voor de links! Ik heb al eerder DNA 2.0 gebruikt voor codonoptimalisatie en gensynthese en heb goede resultaten behaald - ik ben zeker geïnteresseerd in het lezen van hun publicaties.
@Amy: Ja, een deel van de paper gaat over de eigenschappen van DNA2.0, die ik erg handig vind. Ik ben een nieuwe gebruiker en ben nog steeds aan het wennen aan hun software, maar het ziet er tot nu toe best goed uit.


Deze Q&A is automatisch vertaald vanuit de Engelse taal.De originele inhoud is beschikbaar op stackexchange, waarvoor we bedanken voor de cc by-sa 3.0-licentie waaronder het wordt gedistribueerd.
Loading...