Vraag:
Wat is een goed miniprep-protocol voor de klas?
shigeta
2011-12-15 04:39:07 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ik probeer een goed protocol te vinden voor plasmide minipreps en ik kijk naar drie voorbereidingen die ik heb gevonden:

  1. Fenol / chloroform gebruiken
    • extract met fenol: chloroform: isoamylalcohol,
    • isopropanolprecipitatie, 12.000 g spin-down,
    • spoelen met koude 70% ethanol.
  2. Met behulp van lysozym
    • lyseer met lysozym,
    • verwijder pellet,
    • isopropanolprecipitatie,
    • wassen met koude 80% ethanol.
  3. Met behulp van alkalische lysis
    • openen cellen met 80% glucose in EDTA-buffer,
    • SDS en NaOH toevoegen,
    • proteïne / membraan met azijnzuur / acetaat,
    • ispropanolprecipitatie,
    • wassen met koude 70% ethanol.

Ze verschillen allemaal in het openbreken van de cellen en het scheiden van plasmiden van de rest van de cel -- best wel. Kan iemand me helpen erachter te komen welk protocol hier het beste is?

Weet je zeker dat je studenten fenol wilt laten gebruiken? De meeste laboratoria gebruiken waarschijnlijk kits voor DNA-extractie (bijvoorbeeld Quiagen MiniPrep). Het is veel gemakkelijker en ook veiliger.
Ik ga het antwoord van Reven als het beste markeren, omdat het me het meest helpt bij het kiezen uit de protocollen. maar bedankt dat je erop wijst hoe goedkoop de qiagen-kits zijn - ik had gedacht dat ze veel erger waren. je leert wel iets door een protocol te gebruiken, maar de kolommen zijn eenvoudig!
Ter info: terwijl het waar is ongeveer $ 1-2 per pre voor spinkolommen, maar de reagenskosten voor SDS / NaOH ongeveer 40 cent per prep zijn. je moet echter meer dan 100 voorbereidingen treffen om de besparingen te zien.
Ik wilde gewoon updaten dat ik kolommen van biobasic heb gekocht en hoewel het niet zo is voor instructie als deze basisprotocollen, zijn ze zeker goedkoop genoeg en moeten ze worden overwogen voor de klas - overal upvotes.
@MadScientist Spin-kolommen zijn inderdaad de meest gebruikelijke optie, maar er is een pedagogische invalshoek: er valt niet veel te leren over het volgen van een kithandleiding, maar een PCI-extractie leert een aantal belangrijke biochemie. Zelfs als routinematige zuivering wordt uitgevoerd met spinkolommen, kan PCI een waardevolle terugval zijn als je toevallig vastloopt omdat er steeds onzuiverheden door je kolom komen.
uiteindelijk heb ik het gehad over wat elke stap van de spin-voorbereiding doet en het werkt prima. de oude methoden zijn niet echt veel rigoureuzer als je het hebt over pH-veranderende affiniteit voor silica, enz
Vijf antwoorden:
#1
+7
Nick T
2011-12-15 05:09:02 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Het protocol dat ik in mijn genetica-laboratoriumcursus gebruikte, was alkalische lysis, gevolgd door ethanolprecipitatie vergelijkbaar met deze. Niets vreselijk giftigs of waarvoor een zuurkast nodig is (tenminste bij de kleine volumes die worden gebruikt).

De meer praktische, betrouwbare methode is om een ​​miniprepkit te gebruiken (meestal spinkolommen) van een van verschillende leveranciers ( Qiagen, Promega, Bio-Rad, enz.), Die redelijk betaalbaar zijn voor $ 1-2 per bereiding.

Als ik het me goed herinner, is alkalische lysis * de onderliggende methode achter Qiagen DNA-zuiveringskits (miniprep, enz.). Met de spinkolommen uit de kit kun je de alcoholneerslag en -droging elimineren. Klinkt misschien niet veel, maar het is de prijs van de kit waard omdat het meer dan 10 minuten en een gevoelige stap uit het protocol elimineert. Mijn twee cent: je wilt geen fenol gebruiken in de klas.
Alle voorbereidingskits die ik heb gebruikt (Qiagen, Promega, Invitrogen) gebruiken alkalische lysis. Ik hou van de kolommen om me geen zorgen te hoeven maken dat alle ethanol volledig verdampt (ik gebruik ze met een vacuümspruitstuk, dus ik zuig nog een minuut of twee om alles te laten verdampen) of op zoek naar een half onzichtbare pellet .
Als ik dit meer leuk vind, heb ik de qiagen-recepten op Open Wet Ware gevonden. Http://openwetware.org/wiki/Miniprep/Qiagen_kit geeft me een beter gevoel over het gebruik ervan in een klas.
#2
+6
yamad
2011-12-22 15:13:24 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ik denk dat de spinkolomsets de juiste keuze zijn. Zoals reeds vermeld, zijn de voordelen van de kits dat ze gemakkelijk, veilig en (vooral) zijn hoe bijna elk laboratorium tegenwoordig plasmidenzuivering doet.

De grootste kritiek op de commerciële kits is dat je gemakkelijk rond kunt komen zonder iets te weten over wat er werkelijk in de buis gebeurt. Zoals opgemerkt in de commentaren op het antwoord van Nick T, zit er geen geheime gepatenteerde technologie in de kits - ze gebruiken de alkalische lysis -methode. Dit betekent dat je het mechanisme nog steeds in de klas kunt aanleren terwijl je het voordeel van de draaikolommen krijgt.

Een optie, voor lesdoeleinden, is om al je eigen oplossingen te maken en gewoon de draaikolommen op het supernatant na pelleteren van het geprecipiteerde membraan / eiwit. Op die manier krijg je het voordeel dat je aandringt op echte namen voor de oplossingen (NaOH is een meer educatieve naam dan P2) en je kunt de spinkolommen gebruiken in plaats van de ethanolprecipitatie. Ik geloof dat er goedkope bronnen zijn die alleen de spinkolommen verkopen, hoewel ik ze nooit heb gebruikt. Je wilt de ethanolneerslag vermijden omdat het een absoluut minimum van 30 minuten aan het protocol toevoegt (voor mijn protocollen was het meer als 1,5 uur of meer). En wachten tot de ethanol is verdampt zodat je kunt resuspenderen, is als kijken hoe verf droogt, tenzij je een snelvacuüm hebt.

Opbrengst zou geen groot probleem moeten zijn in een klassensituatie, maar je kunt de opbrengst verhogen met de kolom door de laatste elutiestap te verlengen. Ik denk dat de gegeven instructie is om de TE-buffer (Tris) 1 minuut te laten "elueren" voor de laatste spin, maar ik heb de TE routinematig ongeveer 15-30 minuten laten zitten voordat ik hem laat draaien. Het verschil in opbrengst blies de belichting op de gelcamera uit.

Er zijn bepaalde gevallen waarin extracties van fenol: chloroform nog steeds wenselijk zijn, maar dit is er zeker niet een van. Ik deed routinematig P: C's bij het werken met RNA en genomisch DNA van gist. Ik heb nog nooit iemand iets anders zien doen dan een miniprep bij het bereiden van plasmiden. Bovendien hebben het gedoe van het werken in een zuurkast en het risico op fenolverbranding veel mensen in het laboratorium ertoe aangezet om de spin-kits te verkiezen, zelfs wanneer ze met genomisch DNA werken.

na enige moeite zijn we overgestapt naar de spin kits ...
#3
+4
Reven
2011-12-15 05:52:23 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Mijn ervaring is dat de P: C: I-methode hogere opbrengsten oplevert en iets eenvoudiger is (in stappen en chems), maar zoals @Mad Scientist heeft gezegd, kan het gebruik van fenol een probleem zijn. Het hangt af van de leeftijd van uw leerlingen.

Het is niet alleen de leeftijd van de studenten, het hangt ook af van de beschikbare faciliteiten. Je hebt bijvoorbeeld wel een afzuigkap nodig en je hebt een dienst nodig voor het afvoeren van fenol.
Fenol en chloroform zijn zeer giftig en kankerverwekkend en mogen zeker niet worden gebruikt door studenten of buiten een goede zuurkast.
#4
+4
user91
2011-12-15 06:47:21 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Met behulp van spinkolommen hebben mijn professor en ik in een paar uur tijd ~ 30 plasmiden uit ~ 30 monsters geëxtraheerd. Het is gemakkelijk, goedkoop en levert een plasmide van goede kwaliteit op. Mijn monster werd gekwantificeerd door middel van UV-specificaties en was ongeveer 200 ng / ul.

#5
  0
George
2014-02-01 08:25:24 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Om kosten te besparen, kunt u alleen spinkolommen kopen bij leveranciers zoals Syd Labs ( http://www.sydlabs.com/spin-column-for-plasmid-miniprep-p110.htm ) en maak zelfgemaakte buffers. De leveranciers leveren normaal gesproken het bufferrecept.



Deze Q&A is automatisch vertaald vanuit de Engelse taal.De originele inhoud is beschikbaar op stackexchange, waarvoor we bedanken voor de cc by-sa 3.0-licentie waaronder het wordt gedistribueerd.
Loading...